生产用细胞株构建的原理及方法.pdf

⽣产⽤细胞株构建的原理及⽅法 宿主细胞与重组蛋⽩⽣产 动物细胞是⽣产治疗性重组蛋⽩的强有⼒⼯具。为与⼩分⼦药物区别开来，治疗性蛋⽩、疫苗以及细胞 治疗产品统称为⽣物制品。宿主细胞的选择和改造对于提⾼产品的产量和质量来说⾄关重要。因此必须 对细胞进⾏筛选，选出具有⾼表达量和良好⽣长特性的细胞。在此我们主要讨论适⽤于⼤规模⽣产重组 蛋⽩的细胞株的筛选。 ⼯业上重组蛋⽩的制备主要有两种⽅式：瞬时转染和稳定转染。瞬时转染经常⽤于制备少量蛋⽩（多达 克级）⽤于药物开发早期的蛋⽩活性或动物实验。瞬时转染并不产⽣克隆细胞株，它只是暂时将编码外 源蛋⽩的质粒转导⼊已有的细胞株⾥⾯（⽐如HEK293或COS细胞）。随着细胞的分裂外源基因不断丢 失，蛋⽩产量较低，⼀般在1-100mg/L。近年来有报道称HEK293细胞中瞬时表达产量可达1g/L。 与瞬时转染不同，稳定细胞株是为⼯业化⽣产治疗性蛋⽩⽽构建的。稳定细胞株需要具备在不同的时 间，不同的场地以及不同的批次间⽣产相同质量产品的能⼒。在选定⽣产⽤细胞株之后，需要建⽴主细 胞库（mater cell bank ）。从主细胞库复苏后，扩增建⽴⼯作细胞库（working cell bank ），⼯作细胞库⽤ 于⽣产。细胞库通常保存在液氮中，需要维持整个产品的⽣命周期。在构建⽣产⽤细胞株的过程中，宿 主细胞和表达载体⾄关重要。 稳定细胞株构建⾼产细胞株的秘密 CHO和⾻髓瘤细胞是构建稳定细胞株最常⽤的两种宿主细胞。基本上⽤这两类细胞⽣产的治疗性蛋⽩都 能分泌到细胞外，从⽽可以从细胞培养液中收获产物。CHO细胞属于成纤维细胞，是⼀种⾮分泌型细 胞，它本⾝很少分泌内源蛋⽩。 科研⼈员在蛋⽩组学和转录组学⽔平上研究了B细胞变成浆细胞所发⽣的⽣理变化。细胞转变提⾼了能 量代谢⽔平，改善了蛋⽩分泌和糖基化能⼒，同时增加了氧化还原⽔平⽤来应对活性氧的影响。B细胞 或浆细胞的基因组中只有⼀个功能性的免疫球蛋⽩基因。在B细胞成熟的过程中，⼆倍体细胞中其中⼀ 个等位基因发⽣失活。但是，仅仅是免疫球蛋⽩基因的⼀个拷贝⾜以使浆细胞成为⼀个⾼产的分泌细 胞。因此，只需将⽬的基因的⼀个拷贝整合到杂交瘤细胞基因组适合的位置就可以使其成为分泌外源蛋 ⽩的强⼤细胞。与瘤细胞不同，CHO必须经过改造后才能提升蛋⽩表达能⼒。除了蛋⽩表达能⼒之外， 优秀的细胞株还应具备良好的⽣长和代谢特性。在过去的⼗多年⾥，⼤量转录组学和蛋⽩组学的研究致 ⼒于揭⽰⾼产细胞株的特性。⼈们逐渐意识到没有那⼀种主要的调控因素能使CHO或NS0来源的重组细 胞变成⾼产细胞株。⾼产细胞株的形成涉及细胞内许多通路的改变，⽐如代谢、分泌、氧化还原平衡和 ⽣长/死亡调控；更可能的是⼤量基因表达⽔平的微⼩变化，⽽不是⼏个主要节点的⼤变化。 构建⾼产细胞株的基本步骤 •转染-筛选-扩增-单克隆化-筛选-驯化 ⾸先，通过质粒将⽬的蛋⽩的编码基因导⼊到细胞内。质粒上除了⽬的基因外还带有抗性基因，⽐如抗 ⽣素抗性基因。这样在转染后就可以利⽤选择压⼒富集整合质粒的细胞。在哺乳动物细胞中质粒不能进 ⾏复制，未整合到基因组中的质粒随着细胞分裂逐渐丢失。在⼀段时间的选择压⼒后，所有存活下来的 细胞基因组中都整合了外源质粒。 获得了⼀系列整合了外源基因的稳定细胞后，接下来就需要从中筛选出表达量最⾼的克隆。最常⽤的⽅ 法是检测96孔细胞培养板中蛋⽩的浓度；另外⼀个⽅法是让细胞在软琼脂上⽣长形成集落，然后利⽤原 位免疫沉淀技术获得⾼产细胞。近年来，发展起来的⾼通量⾃动化筛选技术也被受关注。 为实现克隆的⾼表达，在有些情况下外源基因扩增，⽐如以CHO⽤作宿主细胞；有些情况则不需要，⽐ 如杂交瘤细胞。为了实现外源基因的扩增，将细胞在⾼浓度的扩增标记（⽐如dhfr）抑制剂的压⼒下⽣ 长。细胞存活需要扩增标记。⾼浓度的抑制剂能够杀死除拥有多个扩增标记基因以外的绝⼤多数细胞。 在标记基因扩增的过程中，与它相邻的基因也随之发⽣扩增。基因拷贝数的增加导致转录和翻译⽔平的 提⾼。在这个过程中，某些⾼产细胞株重组IgG重链的转录⽔平成为细胞内最⾼。另⼀⽅⾯，过⾼的蛋 ⽩表达可能会超过细胞内蛋⽩折叠的限度，内质⽹中发⽣未折叠蛋⽩效应导致细胞凋亡。因此没有建⽴ 起与⾼表达相匹配的其它结构的细胞可能不能存活。 基因扩增后的细胞既含有多个拷贝的外源基因，能⾼⽔平的表达⽬的基因和抗性基因，还具备了强⼤的 蛋⽩分泌能⼒。 基因扩增后的细胞既含有多个拷贝的外源基因，能⾼⽔平的表达⽬的基因和抗性基因，还具备了强⼤的 蛋⽩分泌能⼒。除此之外，⾼产细胞株还应具备⾼密度培养和能维持较长平台期的能⼒。 基因扩增后的细胞可以视为⼀个细胞